ヒトパピローマウイルス粒子の産生と再発性呼吸器乳頭腫症の重症度との関連性

Nov 21, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 5514 (2023) この記事を引用

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再発性呼吸器乳頭腫症（RRP）の重症度は多岐にわたります。 私たちはヒトパピローマウイルス（HPV）粒子の産生とRRPの重症度との関係を調査します。 2005 年 9 月から 2021 年 6 月までに、68 件の RRP サンプル (29 人の患者から) が含まれました。 HPVの型が判明しました。 HPV ウイルス量、身体状態、人口統計および臨床的特徴が評価されました。 p16、Ki-67、L1、および E4 について免疫組織化学 (IHC) を実施しました。 NanoSuit-CLEM (相関光電子顕微鏡) と透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用してサンプルを検査しました。 HPV陽性症例とHPV陰性症例の手術総数は、それぞれ3.78件（n = 55/68、範囲：1～16）と1.30件（n = 13/68、範囲：1～3）でした（p = 0.02） ）。 IHC は、L1 と E4 が相関しており、腫瘍表面に発現していることを示しました。 NanoSuit-CLEM および TEM により、L1 陽性核内の HPV 粒子が明らかになりました。 L1 IHC 陽性症例では、手術間隔が短く (p < 0.01)、手術頻度が高かった (p = 0.04)。 P16 IHC、ウイルス量、身体状態は疾患の重症度と関連していませんでした。 この研究では、RRP における HPV 粒子生成を初めて視覚化しました。 持続的な HPV 粒子感染は重症度と関連していました。 RRP 重症度の評価には、Derkay スコアに加えて L1 IHC を推奨します。

再発性呼吸器乳頭腫症 (RRP) は、ヒトパピローマウイルス (HPV) 6 型または 111,2 型によって引き起こされることが多い良性腫瘍です。 RRP は喉頭乳頭腫症 (LP) 3 としても知られています。 一般に、HPV の関与は患者の 80 ～ 96.9% で報告されています 4,5,6。 しかし、いくつかの研究では、HPV 検出率が約 60% 低いと報告されています 1,2。 さらに、一部の報告は HPV の関与を調査していない 7、8、9。 一部の患者は 1 回の手術で寛解を維持しますが、他の患者は複数回の手術後に悪性転換を発症し、好ましくない転帰をもたらします 10,11。 臨床所見に基づいて疾患の重症度を評価するダーケイ スコアは、RRP12 の重症度を決定するためによく使用されます。 しかし、HPV ライフサイクルなどの病因に基づいて病気の臨床的重症度を調査する研究はほとんど行われていません。 HPV DNAは寛解患者の喉頭粘膜で検出されるため、持続的なHPV感染がRRP13の発症に関与していると考えられています。 しかし、HPV の関与 (または腫瘍によって生成される HPV 粒子の状態) と疾患の重症度との関連を調査した報告はありません。

NanoSuit 法は、高真空条件を必要とする電界放出型走査電子顕微鏡 (FE-SEM) を使用して生きたショウジョウバエの幼虫を観察できることに着想を得た生体模倣技術です 14,15。 NanoSuit技術を応用したNanoSuit-CLEM法（相関光電子顕微鏡法）は、病理組織上にナノ膜を形成し、組織の水分保持や三次元構造の維持を図る技術です。光学顕微鏡観察ではSEM16で観察します。 数分で完了し、簡単にFE-SEM観察が可能です。 私たちはこれまでに、NanoSuit-CLEM法を使用して消化管や唾液腺などのさまざまな病理学的組織を検査しました17、18、19。 さらに、我々はこれまでに、NanoSuit-CLEM法を用いたサイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、HPVなどの各種ウイルスの標準的な観察方法を報告してきた20。

HPV E4 および E5 の mRNA 発現は RRP で高く、疾患の発症に関与している可能性があることが報告されています 21,22。 したがって、我々は、E4 が HPV 粒子の形成と放出に関与しているため、活発な HPV 粒子の産生が RRP の重症度と関連しているのではないかと仮説を立てました。

本研究では、NanoSuit-CLEM法を用いてHPV粒子を観察することにより、RRPにおけるHPVのライフサイクルの解明を試みた。 さらに、我々は、活発なHPV粒子の産生が疾患の重症度と関連していることを示すことを目的としました。

患者の特徴は表 1 にまとめられており、詳細なデータは補足表 S1 にあります。 HPVの型を決定するために直接配列分析を実行しました（補足図S1）。 HPV型患者の平均年齢は44.83歳（範囲：30～69歳、SD：8.67）、57.00歳（範囲：45～69歳、SD：12.53）、60.10歳（範囲：37～86歳、SD：16.04）であった。それぞれ6、11、マイナス。 全例成人発症のRRPであり、治療は手術室にて全身麻酔下に行われた。 HPVワクチン接種を受けた患者はいなかった。 RRR患者はほとんどが男性で(n = 25/29、86.2%)、喫煙歴があり(n = 23/29、79.3%)、アルコール摂取歴があった(n = 24/29、82.8%)。 。 総手術数は、HPV陽性例では3.78件（n = 19/29、範囲：1～16）、HPV陰性例では1.30件（n = 10/29、範囲：1～3）でした（p = 0.02） ）。 さらに、ダーケイスコアは、HPV 陽性例では 6.27 (n = 55/68、範囲: 3 ～ 14)、HPV 陰性例では 4.84 (n = 13/68、範囲: 3 ～ 8) でした (p = 0.02) ）。 しかし、HPV 6 型と 11 型では、総手術数とダーケイ スコアに統計的に有意な差は確認されませんでした (p = 0.10)。 下気道の播種性病変の症例は観察されませんでした。 悪性転換は3例で発生し、すべてHPV陰性でした。

HPV 陽性 RRP 症例では、腫瘍表面 (点線の間の領域) にコイロサイトーシスが見られることがよくありました (図 1A)。 腫瘍表面（主にコイロサイトーシス病変）では、核はHPVのカプシドタンパク質であるL1免疫組織化学（IHC）陽性であり、細胞膜はHPV粒子形成に関与するE4 mRNAおよびタンパク質が陽性であった。そして放します (図 1B–E)。 L1 と E4 は両方とも腫瘍表面上で同様の分布で発現し、同じ細胞内で両方の一部の部位が陽性になっています (矢印) (図 1F)。 P16 IHC は、染色時に弱い分散を示しました (図 1G)。 Ki-67 染色は主に基底層で観察され、陽性細胞の割合は腫瘍表面に向かって減少しました (図 1H)。

病理学的所見。 (A) 核異型および核周囲空胞を伴うコイロサイトーシス病変が腫瘍表面 (点線の間の領域) に観察されます。 (B、C) [(C) は (B) の四角形の拡大図]: 腫瘍表面のコイロサイトーシス病変における陽性細胞を示す HPV L1 IHC (矢印)。 (D) 腫瘍表面コイロサイトーシス病変における HPV E4 発現細胞膜の RNA-in situ ハイブリダイゼーション。 (E) HPV E4 IHC および RNA-in situ ハイブリダイゼーションは、同じ病変について HPV E4 に対して陽性です。 (F) HPV L1 と HPV E4 は腫瘍表面上で同様の分布で発現され、同じ細胞内で両方の一部の部位が陽性になっています (矢印)。 茶色は HPV L1 を示し、赤色は HPV E4 を示します。 (G) P16 IHC は染色時に弱い分散を示します。 (H) Ki-67 IHC 染色は主に基底層で観察され、陽性細胞の割合は腫瘍表面に向かって減少します。 (C) のみ 400 倍の視野で観察され、その他は 200 倍の視野で観察されます。 バーは100μmを示します。 HPV ヒトパピローマウイルス、IHC 免疫組織化学。

免疫反応性スコア（IRS）を使用して、p16 IHC染色を評価しました（補足図S2）。 P16 IRS は、HPV 陽性症例では陰性症例と比較して統計的に有意でした (p < 0.01)。 ただし、HPV 6 型と 11 型の間には統計的に有意な差はありませんでした (p = 0.62)。 (図2A)。 MIB-1 指数は、HPV 陰性症例よりも HPV 陽性症例の方が有意に高かった（p < 0.01）。 しかし、HPV 6 型と 11 型の間には統計的に有意な差はありませんでした (p = 0.87) (図 2B)。 L1 IHC 陽性症例と陰性症例を比較すると、MIB-1 指数は陽性症例の方が統計的に高かった (p < 0.01) (図 2C)。 同様に、E4 IHC は HPV 陽性症例で統計的に高かった (p < 0.01) (図 2D)。

病理学的所見の定量的評価。 (A) P16 染色は、陰性例と比較して、HPV 陽性例、HPV 6 型陽性例、および HPV 11 型陽性例において統計的に有意です (それぞれ p < 0.01、p = 0.02、および p = 0.02)。 (B) MIB-1 指数は、陰性例と比較して、HPV 陽性例、HPV 6 型陽性例、および HPV 11 型陽性例において統計的に有意です (すべて p < 0.01)。 (C) MIB-1 指数は、HPV L1 陽性症例の方が陰性症例よりも有意に高かった (p < 0.01)。 (D) MIB-1 指数は、HPV E4 陽性症例の方が陰性症例よりも統計的に有意です (p < 0.01)。 * は p < 0.05 を示し、** は p < 0.01 を示します。 HPV ヒトパピローマウイルス。

我々は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片中の HPV 粒子の同定を試みました。 HPV 11 型陽性で L1 IHC がよく発現していた症例 5–2 を選択しました。 まず、L1 IHC を実行し、陽性部位の写真を撮影しました (図 3A)。 続いて、１％オスミウムインキュベーションおよびオスミウム蒸着を行った。 L1 IHC 陽性核の矢印部分は FE-SEM を使用して同定されました (図 3B)。 L1 陽性細胞は、オスミウムと 3-3'-ジアミノベンジジン (DAB) の反応によって増強されました。 倍率を上げて核を観察すると、多数の微粒子の存在が明らかになりました (図 3C ～ G)。 HPV 粒子と同じサイズの約 50 ～ 60 nm の典型的な粒子を矢印で示します (図 3G)。

HPV L1陽性細胞におけるHPV粒子の検出。 (A) HPV L1 IHC が実行され、矢印は観察対象を示します。 細胞核は矢印で示されています。 400×の視野が観察されます。 バーは100μmを示します。 (B–G) HPV L1 IHC 陽性細胞核は、NanoSuit-CLEM 法を使用して観察されます。 核は微粒子で満たされています。 HPV 粒子と同じサイズの約 50 ～ 60 nm の典型的な粒子を矢印 (G) で示します。 画像の視野は500×(B)、3000×(C)、10,000×(D)、30,000×(E)、50,000×(F)、100,000×(G)です。 バーは 100 μm (B)、10 μm (C)、5.0 μm (D)、1.0 μm (E)、1.0 μm (F)、および 500 nm (G) を示します。 (H) HPV L1 IHC が実行されます。 矢印は観測対象を示します。 視野は200×です。 バーは100μmを示します。 (I、J) HPV L1 IHC 陽性細胞核は、NanoSuit-CLEM 法を使用して観察されます。 核は微粒子で満たされています。 視野は5000×(I)、30000×(J)です。 バーは 10 μm (I) および 1.0 μm (J) を示します。 (K-M) TEM を用いた NanoSuit-CLEM 法により領域を観察します。 核内にサイズ約50〜60 nmの微粒子が観察され、HPV粒子であると判断されます。 代表的な HPV 粒子は矢印 (M) で示されています。 倍率は5000×(K)、30000×(L)、50000×(M)です。 バーは 2.0 μm (K)、200 nm (L)、および 200 nm (M) を示します。 CLEM 相関光学顕微鏡および電子顕微鏡、HPV ヒトパピローマウイルス、IHC 免疫組織化学。

次に、FE-SEM を用いて核内の微粒子の TEM 観察を試みました。 L1 の IHC を実行し (図 3H)、NanoSuit ソリューション II を適用し、FE-SEM を使用してサンプルを検査しました。 L1 陽性細胞核は微粒子で満たされていました (図 3I、J)。 次に、スライドガラス上の観察組織をエポキシ樹脂で包埋し、極薄標本切片を作製し、TEMで観察しました。 FE-SEMで観察したのと同じ核をTEMでも観察した。 L1 陽性細胞の核には、約 50 ～ 60 nm の微粒子が多数見つかりました (図 3K ～ M)。 したがって、L1 陽性核内の粒子は HPV 粒子であると結論付けました。

さらに、HPV 粒子の出現方法が HPV 型ごとに異なるかどうか、また粒子がどのように形成されるかを調べようとしました。 HPV 6 型と 11 型の両方の陽性例において、光学顕微鏡検査を使用すると腫瘍の表層で L1 IHC が強く陽性であり、FE-SEM を使用すると、これらの細胞は核内に微粒子で満たされていることが観察されました (図 4A、 B、G、H）。 わずかに下の層では、HPV 6 型と 11 型の両方の陽性例で、L1 IHC は光学顕微鏡でわずかに陽性であり、核内の粒子構造は数が減少し、不明瞭でした（図 4A、C、G、I）。 。 光学顕微鏡検査を使用すると、顆粒層、有棘層、および基底層に L1 IHC 陽性細胞は見つかりませんでした。また、核には微粒子構造は観察されませんでした（図 4A、D–G、J–L）。 HPV 6 型と 11 型の間では、微粒子の形態学的差異は観察されませんでした。HPV 陰性の場合、光学顕微鏡を使用して L1 IHC 陽性細胞は検出されず、核内に微粒子構造も観察されませんでした（図 4M-R）。 。

HPV粒子形成プロセス。 (A-F) HPV 6 型の場合の粒子形成プロセス。 HPV L1 IHCを行っており、矢印は観察対象を示しています。 200×の視野が観察されます。 バーは 100 μm (A) を示します。 HPV L1 IHCが強く染色されている領域（B）では、多数のHPV粒子が観察されますが、HPV L1 IHCが弱く染色されている領域（C）では、HPV粒子の数が減少し、一部の粒子が未熟であるように見えます。 HPV L1 IHC 陰性病変に HPV 粒子が見られない領域 (D ～ F)。 50,000 × 視野では、白いバーは 1.0 μm (B ～ F) を示します。 (G-L) HPV 11 型症例における粒子形成のプロセス。 HPV L1 IHCが行われており、矢印は観察対象を示しています。 200×の視野が観察されます。 黒いバーは100μm(G)を示します。 HPV L1 IHCが強く染色されている領域（H）では多数のHPV粒子が観察されますが、L1が弱く染色されている領域（I）ではHPV粒子の数が減少し、一部の粒子が未熟であるように見えます。 HPV L1 IHC 陰性病変に HPV 粒子が見られない領域 (J-L)。 50,000 × 視野では、白いバーは 1.0 μm (H–L) を示します。 (M-R) HPV 陰性の症例。 HPV L1 IHCが行われており、矢印は観察対象を示しています。 200×の視野が観察されます。 黒いバーは100μm(M)を示します。 HPV粒子は観察されません(N-R)。 50,000 × 視野では、白いバーは 1.0 μm (N-R) を示します。 HPV ヒトパピローマウイルス、IHC 免疫組織化学。

次に、活発な HPV 粒子の産生を特徴とする L1 IHC 陽性症例の臨床的重症度を調べました。 図５Ａにおいて、バーの色は手術間隔のタイミングを示し、長さは各手術間隔を表す。 星印は陽性の L1 IHC を示します。 L1 IHC 陽性症例の数は不均一に分布しており、手術回数は多く、手術間隔は短かった (図 5A)。 手術回数は、L1 IHC 陽性患者の方が有意に多かった (p = 0.04) (図 5B)。 さらに、L1 IHC陽性患者では手術間隔が有意に短かった（p < 0.01）（図5C）。

L1 IHC と臨床的重症度との関連性。 (A) HPV L1 IHC は、手術回数が多く、手術間隔が短い場合に陽性となる場合があります。 縦軸は件数、横軸は日数を示します。 バーの色は手術間隔のタイミングを示し、長さは各手術間隔を表します。 星は HPV L1 IHC 陽性を示します。 (B) 総手術数は、L1 IHC 陽性症例の方が有意に多くなります (p = 0.04)。 (C) L1 IHC 陽性症例では手術の間隔が有意に短くなります (p < 0.01)。 * は p < 0.05 を示し、** は p < 0.01 を示します。 HPV ヒトパピローマウイルス、IHC 免疫組織化学。

次にウイルス量と体調を調べました。 HPV ウイルス量は HPV 6 型と 11 型の間で差はなく (p = 0.96) (図 6A)、HPV 11 型の症例数は E2/E6 で有意に低かった (p < 0.01) (図 6B)。 この結果は、HPV 11 型が 6 型よりも統合されていることを示しています。HPV ウイルス量および E2/E6 は、MIB-1 指数との相関を示さなかった（r = 0.07、p = 0.66、および r = 0.12、p = 0.44）（図） .6C、D）。

HPVウイルス量と身体状態の評価。 (A) ウイルス量は、HPV 6 型と 11 型の間で差異を示しません (p = 0.96)。 (B) HPV 11 型レベルは E2/E6 で大幅に低下しています (p < 0.01)。 (C) ウイルス量は MIB-1 インデックスとの相関を示しません (r = 0.07、p = 0.66)。 (D) E2/E6 は MIB-1 インデックスとの相関を示しません (r = 0.12、p = 0.44)。 **は p < 0.01 を示します。 HPV ヒトパピローマウイルス。

また、ダーケイスコアと IHC、HPV ウイルス量、身体状態、手術間隔との相関関係も評価しました。 L1 IHC 陽性を 1、陰性を 0 と定義しました。L1 IHC 陽性は、高いダーケイ スコアと関連していました (オッズ比: 1.28、95% 信頼区間: 1.04 ～ 1.57、p = 0.02)。 MIB-1 インデックスと重症度の尺度である Derkay スコアは、弱い正の相関関係を示しました (r = 0.23、p = 0.07) (図 7A)。 対照的に、中咽頭癌におけるHPVの代替マーカーであるp16 IHCとダーケイスコアは、弱い負の相関を示しました（r = - 0.23、p = 0.06）（図7B）。 L1 IHC 陽性とダーケイ スコアは関連しているため、HPV ウイルス量と E2/E6 がダーケイ スコアと相関していると予想されました。 ただし、相関は観察されませんでした（それぞれ r = − 0.004、p = 0.976 および r = 0.006、p = 0.966）（図 7C、D）。

Derkay スコアの散布図と回帰直線。 (A) MIB-1 インデックスと Derkay スコアは弱い正の相関を示します (r = 0.23、p = 0.07)。 (B) P16 IHC と Derkay スコアは弱い負の相関を示します (r = − 0.23、p = 0.06)。 (C) ウイルス量とダーケイスコアは相関を示しません (r = − 0.004、p = 0.976)。 (D) E2/E6 スコアと Derkay スコアは相関を示しません (r = 0.006、p = 0.966)。 (E) 手術のたびに、ダーケイ スコアの平均変化に有意な傾向はありません。 (F) 手術間隔とダーケイスコアは負の相関を示します (r = − 0.40、p = 0.01)。 IHC 免疫組織化学、DS Derkay スコア。

手術の各時間におけるダーケイスコアの平均変化には有意な傾向は観察されなかった（図７Ｅ）。 手術間隔とダーケイスコアは負の相関を示しました（r = − 0.40、p = 0.01）（図7F）。 これは、手術間隔が重症度の有用な指標となる可能性があることを示しています。

HPV は、エンベロープを持たない、サイズ約 50 ～ 60 nm の二本鎖 DNA ウイルスです23。 寛解期の喉頭粘膜にはHPV DNAが検出されるため、持続感染がRRP13の発症原因であると考えられている。 この研究で、IHC は、キャプシドタンパク質である L1 と HPV 粒子形成に関与する E4 が RRP 組織で相関していることを明らかにしました 24,25。 さらに、L1 IHC 陽性細胞を NanoSuit-CLEM および TEM で観察したところ、核内にサイズ約 50 ～ 60 nm の微粒子が存在することがわかりましたが、L1 IHC 陰性細胞の核では同様の所見は観察されず、これらの粒子はHPV粒子。 さらに、この研究は、HPV粒子が腫瘍表層を形成し始め、上方に移動するにつれて数が増加することを示唆しています。 この研究は、重症RRPにおいてHPV粒子が継続的に生成され、持続感染を引き起こす可能性があることを初めて証明した。 言い換えれば、FFPE セクションを使用して RRP 内の HPV ライフサイクルの一部を視覚化することに成功しました。

この研究はHPVの関与にも焦点を当てました。 RRP に関する最近の論文に基づくと、HPV の頻度は 80% 以上であると報告されています 4,5,6 が、HPV の関与が約 60% であることを示した報告もいくつかあります 1,2。 HPV が関与しているかどうかを検査せずに臨床診断が行われた報告も存在します 7、8、9。 PCR、L1 IHC、E4 IHC、およびE2/E6のqPCRによってHPVを検査しましたが、これらはすべてHPV陰性の場合には検出できません。 これらの結果は、臨床的にRRPと診断された乳頭腫の病理学的症例であってもHPV陰性症例が存在することを示している。 成人発症のLPでは、HPV陽性症例の年齢層が低かった。 RAS の遺伝子変異は HPV 陰性症例で報告されています 26。 遺伝子変異が主な病因であるため、彼らは高齢である可能性があります。 今回のデータは、HPV 陰性 RRP が高齢化する傾向も示しました。 一方、HPV 6 型と 11 型の陽性 RRP の年齢は多くの報告で差がありませんでした。 したがって、この研究における有意な差は、サンプルサイズが小さいことに起因すると考えられます。

RRP の重症度は広範囲にわたるため、疾患の重症度を判断することが重要です。 ダーケイ スコアは広く使用されている評価ツールです。 若年性発症型RRP患者721人を調査した研究では、高いダーケイスコアが再発の危険因子であることが報告された27。 ただし、ダーケイ スコアの 2 つの制限は、このスコアでは再発部位を予測できないこと、および腫瘍サイズやその他の要因について明確な基準が存在しないため、スコアが評価者ごとに異なる可能性があることです。 もう 1 つのよく知られた危険因子は、HPV 1127、28、29 型の関与です。 この研究では、HPV 6 型と 11 型の間で手術回数に差はありませんでした。 ただし、HPV 陽性患者と HPV 陰性患者の間には統計的に有意な差がありました。 さらに、L1 IHC陽性症例では手術間隔が短く、手術回数が多いことが判明し、これはHPV粒子の産生が活発であることを示しています。 これらの発見は、HPV 粒子の持続的な産生が持続的な感染を引き起こすことが、RRP の主な病因であることを示唆しています。 手術と HPV ワクチン接種を組み合わせると、再発のリスクが軽減されることが報告されています 30,31。 これらのレポートはこの仮説を裏付けています。 診断までの時間が混乱要因となる可能性があります。 ただし、この研究の L1 IHC 陽性症例を見ると、実施された手術に関係なく陽性である傾向があります (図 5A および補足表 S1、症例 5、8、22、23)。 さらに、短い手術間隔であっても、L1 IHC 陽性が発生する可能性があります。 したがって、時間よりも免疫応答などの患者要因の方が関係がある可能性があります。 さらに、L1 IHC 陽性が高いデルケイスコアと関連していることもわかりました。 ただし、L1 IHC と Derkay スコアは異なる側面を評価する可能性があります。 デルケイスコアは、複数の病変がなければ高いとは考えられず、持続性 HPV 感染の病態生理学を評価することはできません。 さらに、L1 IHC はスライドガラス上の組織のみを評価するため、腫瘍全体を評価することはできません。 しかし、それは活発な HPV 粒子の産生の強力な証拠を示しています。 したがって、ダーケイスコアと HPV 粒子形成は、RRP のさまざまな側面を評価できる可能性があります。 対照的に、ダーケイスコアと HPV32、33 の既知の代用マーカーである p16 IHC の間には、弱い負の相関関係が観察されました。 したがって、RRP の重症度を正確に評価するには、デルケイ スコアに加えて L1 IHC の検査を行うことをお勧めします。

ウイルス量や体調なども調べた。 HPV 6型と11型ではウイルス量に差はなかったが、HPV 11型が統合型優勢であった。 対照的に、ウイルス量と身体状態は MIB-1 指数と相関しませんでした。 さらに、ウイルス量と身体状態はデルケイスコアと相関しませんでした。 以前の報告では、寛解が達成されるまでウイルス量は手術のたびに徐々に減少することが明らかになりました 34 が、他の報告ではウイルス量と身体状態は腫瘍体積に関連しないことが示されました 22。 したがって、コンセンサスは存在しません。 ウイルス量は同じ症例内でも大きく異なりました。 ウイルス量はサンプリングされる部位によって異なる場合があります。 ただし、サブサイトごとにサンプルを採取していないため、この点については検討できませんでした。 これらの発見を解明するにはさらなる研究が必要です。 ただし、ウイルス量と身体状態は臨床的重症度の指標ではないようです。

FFPE 切片で HPV 粒子を特定し、HPV 粒子の観察は RRP 重症度と関連していました。 ただし、この研究にはいくつかの限界がありました。 この研究の症例数は少数でしたが、29 症例は RRP 研究としては比較的大きなサンプルと考えられるかもしれません。 この研究には、若年性発症RRP、HPVワクチン接種患者、および下気道病変は含まれていませんでした。 したがって、このような場合に L1 IHC が有効であるかどうかは不明のままです。 手術間隔よりも再発間隔の方がより良い指標と思われますが、再発のタイミングを正確に判断するのは困難であるため、この研究では手術間隔を指標として使用しました。 ただし、手術間隔はダーケイスコアと相関があるため、重症度の有用な指標となりえます。 悪性転換を起こした患者は全員 HPV 陰性でした。 台湾からの報告では、HPV 陰性状態が悪性転換の危険因子であることが示唆されています 35。 したがって、HPV 陰性状態が悪性転換の危険因子である可能性がありますが、この点については詳細に研究していません。

結論として、NanoSuit-CLEMとTEMを使用して、FFPE切片におけるRRPのHPVライフサイクルの一部を可視化することに初めて成功しました。 継続的な HPV 粒子生成による HPV 粒子の持続的感染は、臨床的重症度と相関します。 L1 IHC は、Derkay スコアに加えて RRP の重症度を評価するために重要です。

浜松大学医学部、聖隷浜松総合病院、聖隷三方原総合病院、藤枝市立総合病院で手術を受けた患者29人から68個のRRPサンプルを採取した。 サンプルは2005年9月から2021年6月までに採取されました。すべての症例は研究に含まれる前に病理学的に乳頭腫と診断されました。 いずれの症例もその都度腫瘍を全摘出し、腫瘍が残存する症例は除外した。 可能な限り、再発観察後数か月以内に手術が行われました。 この研究計画は、浜松大学医学部治験審査委員会によって承認された（承認番号：19-222）。 すべての方法はヘルシンキ宣言に従って実行されました。 すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。 患者の年齢、性別、アルコール曝露、喫煙状況、ダーケイスコア、手術日などの医療情報が患者記録から取得されました。

ダーケイ スコアは、広く使用されている重症度評価方法です。 ダーケイスコアの計算式は、「各部位の腫瘍の大きさから計算された点数の合計」に「臨床所見から計算された点数」を加えたものです。 腫瘍サイズの評価は、気道消化管を 25 のサブサイトに分割し、それぞれに 0 ～ 3 のスコアが与えられます (0 = 病変なし、1 = 表面病変、2 = 盛り上がった病変、および 3 = 大きな病変)。 臨床所見の評価は、患者の声 (0 = 正常、1 = 異常、2 = 無声)、患者の喘鳴 (0 = 不在、1 = 活動あり、2 = 安静時にあり)、今日の介入の緊急性に基づいています。 (0 = 予定、1 = 選択的、2 = 緊急、3 = 緊急)、および呼吸困難のレベル (0 = なし、1 = 軽度、2 = 中等度、3 = 重度、4 = 極度)12。

DNA 抽出用の組織は、腫瘍体積が最大の領域からサンプリングされました。 この研究のための組織サンプリングが不十分な場合には、FFPE 組織から DNA を抽出しました。 QIAamp DNA Mini Kit または QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して DNA を抽出しました。 TaKaRa PCR ヒトパピローマウイルスタイピングセット (タカラバイオ、草津、日本) プライマーセットを HPV の検出に使用しました。 PCRによってHPV陽性として検出されたサンプルは、3500xL Genetic Analyzer（Applied Biosystems、Waltham、MA、USA）を使用した直接配列分析に供されました。 HPV 型は、BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) を使用して配列を検索することによって決定されました。

HPV 6 型または 11 型のウイルス量と身体的状態は、StepOne リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用した qPCR によって評価されました。 HPV 6 型および 11 型に特異的な E2 および E6、およびアクチン ベータのプライマーが設計されました (補足表 S2)。 E2、E6、およびアクチン ベータの標準曲線は、以前に記載されているようにクローニング プラスミドを使用して設定されました 21、22、34。 DNA 1 ナノグラムあたりの E6 コピー数をウイルス量として定義しました。 E2 コピー数/E6 コピー数の比は、HPV の物理的状態を表します。 E2/E6 < 1 は統合型とエピソーム (混合) 型の両方が存在することを示し、E2/E6 ≥ 1 はエピソーム型が優勢であることを示し、E2/E6 = 0 は統合型のみを示します36。

FFPE 組織切片 (厚さ 4 μm) を調製しました。 抗原回復は、エピトープ回復溶液 pH 9 (Leica Biosystems、Wetzlar、ドイツ) を使用して実行されました。 内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、切片を 0.3% H2O2 メタノール溶液中でインキュベートしました。 10% ヤギ血清 (ニチレイ バイオサイエンス、東京、日本) を使用して切片をブロックしました。 使用した一次抗体は、HPV-L1 抗体 (K1H8) (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)、p16 (E4H6) (Roche、バーゼル、スイス)、および Ki-67 (MIB-1) (DAKO、サンタクララ) でした。 、カリフォルニア州、米国）。 前述のように、HPV 6 型 E4 および 11 型 E4 抗体も使用しました 21。 二次抗体には、MAX-PO(M) または MAX-PO(R) キット (ニチレイバイオサイエンス、東京、日本) を使用しました。 セクションは DAB で視覚化されました。

L1 と E4 の二重染色は L1 によって実行され、DAB によって視覚化され、E4 は ImmPACT Vector Red AP Substrate Kit (Vector Laboratories、Newark、CA、USA) を使用して視覚化されました。

IHC 評価は、患者情報を知らされていない 2 人の病理学者によって独立して実行されました。 IHC は L1 および E4 について陽性または陰性として評価され、MIB-1 指数は Ki-67 IHC 陽性細胞/全腫瘍細胞のパーセンテージとして計算され、p16 は染色強度をパーセンテージとして使用して免疫反応性スコア (IRS) として計算されました。陽性腫瘍細胞の数（補足図S2）37。

HPV 6 型 E4 および 11 型 E4 プローブを使用しました。 プロトコルは以前に説明されました21、22。 簡単に言うと、ジゴキシゲニン標識プローブを調製し、60℃で一晩ハイブリダイズさせました。 検出はニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸溶液により実施した。

L1抗体によるIHCを実施（DAB染色）。 次に、FE-SEMによる観察箇所の画像を取得した。 スライドを1%オスミウム溶液とともに5分間インキュベートした。 オスミウムはDABと特異的に反応し、FE-SEM38で観察すると増強されます。 オスミウム蒸着は、オスミウムコーター（HPC-1SW）（真空装置、水戸市、日本）を使用して実行されました。 FE-SEM 観察には Hitachi S-4800 電界放射型走査電子顕微鏡 (日立、東京、日本) を使用し、加速電圧 5.0 kV で操作しました。 画像はイットリウム - アルミニウム - ガーネット後方散乱電子 (YAG-BSE) モードで取得されました。

FFPE 組織のセクション。 (厚さ 8 μm) は、コーティングされていないガラスを使用して作成されました。 NanoSuit Solution II (Nisshin EM、東京、日本) をスライドに塗布し、スピンコーターで 3000 rpm で回転させてナノフィルムを作成しました。 次に、FE-SEM観察を行った。 スライドガラス上の FFPE 組織切片を 2% グルタルアルデヒドおよび 2% 四酸化オスミウムで再固定し、エポキシ樹脂 (Nisshin EM、東京、日本) に包埋しました。 FE-SEM観察領域を統一するためにブロック(0.5mm2)を切り出しました。 極薄スライド (60 ～ 80 nm) を準備し、酢酸鉛と酢酸ウランで染色しました。 透過型電子顕微鏡 (TEM) 観察には JEM-1400 (日本電子、東京、日本) を使用しました。

2 つのカテゴリーの 2 つの母集団のデータは、フィッシャーの直接確率検定の対象となりました。 フィッシャーの正確確率検定は両側検定を使用して実行されました。 関連データには、性別、喫煙、アルコール、悪性転移などが含まれます。 ウェルチの t 検定を適用して 2 つのデータセットを比較しました。 ウェルチの t 検定は両側検定を使用して実行されました。 関連データには、年齢、総手術回数、ダーケイスコア、IHC データ、ウイルス量が含まれます。 これらのデータは分散の均一性を示さなかったため、Welch の t 検定を実行しました。 ピアソン積率相関係数を使用して、2 つのデータまたは確率変数間の線形関係の強さを評価しました。 二項ロジスティック回帰分析を、L1 IHC とダーケイ スコアの間の関連性を決定するために適用しました。 統計的有意性は p < 0.05 に設定されました。 統計分析は、SPSS ver.26 (IBM Corp.、米国ニューヨーク州アーモンク) および KyPlot ver.6.0.2 (KyensLab、東京、日本) を使用して実行されました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

折田 裕也 他喉頭扁平上皮乳頭腫はヒトパピローマウイルスと深く関連しています。 日本 Ｊ．クリン． オンコル。 改訂 48、350–355 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Davids, T.、Muller, S.、Wise, JC、Johns, MM & Klein, A. 成人における喉頭乳頭腫症関連異形成：有病率と HPV サブタイプに関する最新情報。 アン。 オトル。 リノール。 喉頭。 123、402–408 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

Rivera, GA & Morell, F. 喉頭乳頭腫 (StatPearls Publishing、2022)。

Google スカラー

Amiling、R. et al. 米国における若年性発症再発性呼吸器乳頭腫症、疫学と HPV の種類 - 2015 ～ 2020 年。 J. 小児感染症。 ディス。 社会 10、774–781 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

ベダード、MCら。 HPV 株は、若年発症再発性呼吸器乳頭腫症の重症度を予測し、疾患のスクリーニングに影響を与えます。 Cancers (バーゼル) 13、2556 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カルヴァーリョ、AMAS et al. 再発性呼吸器乳頭腫症：ブラジル人集団における臨床的特徴とウイルスの遺伝子型解析。 Rev.Inst. 医学。 トロップ。 サンパウロ 63、e63 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Tkaczuk、A. et al. 成人における重度の呼吸器乳頭腫症の治療のための非経口ベバシズマブ。 喉頭鏡 131、E921–E928 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ペンシルバニア州ベネディクトら。 再発性呼吸器乳頭腫症の解剖学的分布に関する前向き多施設研究。 喉頭鏡 132、2403–2411 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

ロビンス、Y.ら。 再発性呼吸器乳頭腫症患者におけるPD-L1とTGF-bの二重遮断。 J.イミュノザー。 がん 9、1–9 (2021)。

記事 Google Scholar

金澤 哲 ほかヒトパピローマウイルス6型感染とp53過剰発現に関連した再発性呼吸器乳頭腫症の悪性化の稀な症例。 Springerplus 2、2–7 (2013)。

記事 Google Scholar

コネチカット州アレンら。 悪性度の再発性呼吸器乳頭腫症患者における PD-L1 遮断の安全性と臨床活性。 J.イミュノザー。 がん 7、1–9 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Derkay、CS et al. 再発性呼吸器乳頭腫症における疾患の重症度および治療に対する反応を評価するための病期分類システム。 喉頭鏡 108、935–937 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Steinberg、BM、Topp、WC、Schneider、PS & Abramson、AL 臨床的寛解中の喉頭パピローマウイルス感染症。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 308、1261–1264 (1983)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

高久 裕 ほか薄いポリマー膜、ナノスーツは、空気と高真空の間の連続体全体での生存を強化します。 手順国立アカド。 科学。 USA 110、7631–7635 (2013)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

針山 哲 ほか顕微鏡とバイオミメティクス: NanoSuit® メソッドと画像検索プラットフォーム。 顕微鏡法 (オックスフォード) 71、1–12 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

川崎博 ほか NanoSuit 法: 相関光学顕微鏡および電子顕微鏡により非破壊的にパラフィン切片を検査するための新しい組織学的アプローチ。 研究室投資する。 100、161–173 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

新村和也ほか食道胃十二指腸粘膜におけるリン酸ランタン沈着の診断における、「NanoSuit」相関光学および電子顕微鏡法を使用した走査型電子顕微鏡元素分析の有用性。 診断 10、1 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

大石正人ほか補正光学顕微鏡および電子顕微鏡ナノスーツ法を使用した、パラフィン切片内のイオン交換樹脂の沈着の診断。 診断 11、1193 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

新村和也ほか基底細胞/筋上皮分化を示す原発性繊毛陽性唾液腺腫瘍の同定と特徴付け。 Ｊ．パソール。 254、519–530 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

伊藤哲也 ほか相関光および走査型電子顕微鏡を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋切片内の活性子孫ウイルス粒子を同定します。 研究室投資する。 103、100020 (2023)。

論文 PubMed Google Scholar

池上徹 ほか喉頭乳頭腫の研究のための HPV-6 および HPV-11 に対する抗体の開発。 ウイルス 13、1 ～ 14 (2021)。

記事 Google Scholar

池上徹 ほか喉頭乳頭腫における HPV-6 遺伝子の主な E4 および E5 発現との協調した発現。 微生物 9、1–18 (2021)。

記事 Google Scholar

ドアバー、J. 他ヒトパピローマウイルスの生物学とライフサイクル。 ワクチン 30、F55 ～ F70 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Doorbar、J. E4 タンパク質。 構造、機能、表現パターン。 ウイルス学 445、80–98 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

若林、R.、中浜、Y.、Nguyen、V. & Espinoza、JL ヒトパピローマウイルス誘発発癌における宿主微生物の相互作用。 微生物 7、1 ～ 22。

記事 Google Scholar

佐々木 E.、真砂 K.、藤田 S.、花井 N.、矢田部 Y. 頭頸部の扁平上皮乳頭腫における頻繁な KRAS および HRAS 変異。 Ｊ．パソール。 クリン。 解像度 6、154–159 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qu, X.、Xiao, Y.、Ma, L.、Niu, Z. & Wang, J. 若年性呼吸器乳頭腫症患者における高い再発率とその危険因子。 ユーロ。 アーチ。 耳鼻咽喉科。 279、4061–4068 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

Gerein, V.、Rastorguev, E.、Gerein, J.、Draf, W. & Schirren, J. 再発性呼吸器乳頭腫症患者における悪性転移の発生率、発症年齢、および潜在的な理由：20 年の経験。 耳鼻咽喉科。 頭頸部外科手術 132、392–394 (2005)。

論文 PubMed Google Scholar

レイディ首相ほか再発性呼吸器乳頭腫関連癌におけるヒトパピローマウイルス 11 型の組み込み。 喉頭鏡 114、1906 ～ 1909 年 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

Smahelova, J. et al. 再発性呼吸器乳頭腫症患者におけるヒトパピローマウイルスワクチン接種後の転帰：非ランダム化臨床試験。 JAMA耳鼻咽喉科。 頭頸部外科手術 148、654–661 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

松崎洋介 ほか再発性呼吸器乳頭腫症に対するヒトパピローマウイルスワクチン接種の複数年にわたる効果。 喉頭鏡 130、442–447 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

クリンゲンバーグ、B.ら。 P16INK4A の過剰発現は、HPV とは関係なく、腫瘍のない扁桃組織で頻繁に検出されます。 組織病理学 56、957–967 (2010)。

論文 PubMed Google Scholar

AD シンギおよびウィスコンシン州ウェストラ 将来の臨床経験に基づく、ヒトパピローマウイルス関連頭頸部がんの検出におけるヒトパピローマウイルス in situ ハイブリダイゼーションと p16 免疫組織化学の比較。 Cancer 116、2166–2173 (2010)。

PubMed Google Scholar

Deng, Z. et al. 成人発症喉頭乳頭腫における HPV-6 の上流調節領域の CpG 部位のメチル化、物理的状態および mRNA 発現。 オンコターゲット 8、85368–85377 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、LAら。 台湾では喉頭乳頭腫の悪性化の発生率が高い。 喉頭鏡 118、50–55 (2008)。

論文 PubMed Google Scholar

池上徹 ほか鰓裂嚢胞におけるヒトパピローマウイルスの検出。 オンコル。 レット。 16、1571–1578 (2018)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

Remmele, W. & Stegner, HE 乳がん組織における免疫組織化学的エストロゲン受容体検出 (ER-ICA) のための免疫反応性スコア (IRS) の統一定義に関する推奨事項。 病理。 8、138–140 (1987)。

CAS PubMed Google Scholar

新井 裕也 ほか免疫組織化学におけるジアミノベンジジンの重金属増強技術により、低真空走査型電子顕微鏡による超微細構造観察が可能になります。 Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． サイトケム。 70、427–436 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

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著者らは、優れた技術サポートをしていただいた大月義郎氏、太田勲氏、毛利裕子氏、鈴木裕美氏に感謝いたします。 また、装置の使用を許可していただいた浜松医科大学先端医療フォトニクス教育研究センターに感謝いたします。

本研究は、文部科学省の日本学術振興会科学研究費補助金（課題番号 20K09689、20K18249、20K18250、20K18277）の助成を受けて行われました。そしてHUSM科学研究費補助金。

〒431-3192 静岡県浜松市東区半田山1-20-1 浜松大学医学部耳鼻咽喉科・頭頸部外科

Satoshi Yamada, Atsushi Imai, Daiki Mochizuki, Hiroshi Nakanishi, Ryuji Ishikawa, Junya Kita, Yuki Nakamura, Yoshinori Takizawa & Kiyoshi Misawa

優れた医療フォトニクス教育研究センター 浜松大学医学部ナノスーツ研究所 〒431-3192 静岡県浜松市東区半田山1-20-1

Satoshi Yamada, Toshiya Itoh, Takahiko Hariyama & Hideya Kawasaki

浜松大学医学部産婦人科

Toshiya Itoh

琉球大学大学院医学研究科耳鼻咽喉科・頭頸部外科学

Taro Ikegami & Mikio Suzuki

聖隷浜松総合病院耳鼻咽喉科（浜松市）

Jun Okamura

聖隷三方原総合病院耳鼻咽喉科（浜松市）

Yoshihiro Noda

浜松大学医学部再生感染病理学教室（浜松市）

Toshihide Iwashita & Hideya Kawasaki

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HK、KM、SY がこの研究を発案し、実験を計画しました。 SY、TI、TI、DM、RI、YT、JO、YN が実験を行いました。 SY、AI、HN、JK、YN、TI、TH、MS、KM がデータ分析を実行しました。 著者全員が原稿を書き、草稿をレビューし、最終版を承認し、提出に同意しました。

Correspondence to Kiyoshi Misawa or Hideya Kawasaki.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

山田 哲也、伊藤 哲也、池上 哲也 他ヒトパピローマウイルス粒子の産生と再発性呼吸器乳頭腫症の重症度との関連性。 Sci Rep 13、5514 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-32486-8

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受信日: 2023 年 1 月 23 日

受理日: 2023 年 3 月 28 日

公開日: 2023 年 4 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32486-8

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