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Aug 25, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 16730 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

いくつかの最近の研究では、痛みを伴う臨床症状における光生体調節療法 (PBMT) の有効性が確立されています。糖尿病性神経障害 (DN) は、末梢神経における p38 などのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) の活性化に関連している可能性があります。 MAPK 経路は、インターロイキン TNF-α や IL-1β などの細胞外刺激に応答して活性化されます。我々は、ストレプトゾトシン（STZ）誘発糖尿病性神経障害ラットにおけるPBMTの鎮痛能と、MAPK経路制御およびカルシウム（Ca2+）動態に対するPBMTの影響を検証した。次に、PBMTをL4〜L5後根神経節（DRG）領域に適用すると、糖尿病性神経障害ラットのDRGにおける痛覚過敏の強度が低下し、TNF-αおよびIL-1βレベルが低下し、DRGにおけるp38-MAPK mRNA発現が減少することを観察しました。 DN は、TRPV1+ ニューロンと共局在するリン酸化 p38 (p-38) MAPK の活性化を誘導しました。 PBMT は p-38 の活性化を部分的に阻止しました。 DN は炎症誘発性インターロイキンによる p38-MAPK 発現の増加に関連しており、PBMT (904 nm) 治療はこの状態を打ち消しました。また、Ca2+ 動態中に示された高血糖状態による DRG ニューロンの感作は PBMT によって軽減され、その抗痛覚過敏効果に寄与しました。

糖尿病はさまざまな形で末梢神経系 (PNS) に損傷を与える可能性があり、糖尿病性神経障害 (DN) は未治療の糖尿病で最も一般的な合併症の 1 つです1。 DN は末梢神経に影響を与える慢性複合疾患で、上肢と下肢に痛みを伴う症状を引き起こします 1,2,3,4 。発症率は糖尿病患者の約 70% です 5,6。高血糖が末梢神経損傷を引き起こすメカニズムはあまり明らかではありませんが、いくつかの代謝経路が影響を受けることが知られています7。主なイベントには、アルドースリダクターゼ (AR) の活性化 8,9,10,11、タンパク質のグリコシル化、および終末糖化生成物 (AGE) の生成を介したポリオール経路が関与します 10,12,13。さらに、酸化ストレスに関連するフリーラジカルの形成 14,15、神経栄養サポートの減少 16,17、およびプロテインキナーゼ C 活性化 (PKC) の増加 9,18 が末梢損傷に寄与します。代謝の不均衡の結果として、ミトコンドリア不全 10、19、20 および炎症過程も頻繁に発生し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) のリン酸化に関連しています 21、22、23、24、25。

MAPK は、細胞外刺激を細胞内の翻訳後および転写反応に伝達する役割を担うセリン/スレオニンプロテインキナーゼのファミリーです 26、27、28。これは、p38-MAPK、細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ (ERK1/2)、および c-Jun N 末端キナーゼ/ストレス活性化プロテインキナーゼ (SAPK/JNK) で構成されます 29。 MAPK の 3 つの主要なサブファミリー (p38、ERK1/2、および JNK) は、遺伝子転写、タンパク質合成、細胞周期、増殖、分化、およびアポトーシスといったいくつかの機能を調整します 30、31、32、33。炎症誘発性サイトカイン 34、35、36 や酸化ストレス 30、37 などの細胞外刺激は、Ca2+ 動態の影響下でも MAPK 経路を活性化する可能性があります 38、39。膜の脱分極は、L 型カルシウムチャネルを介したカルシウムの流入を促進し、MAPK39 をリン酸化する MEK1 を活性化します。糖尿病ラットの末梢感覚ニューロン42、特に後根神経節（DRG）43、44、45、46でp38の活性化が見られると、高血糖はMAPKのリン酸化を刺激する可能性のある要因の1つであると思われる40、41。同様に、JNK のリン酸化は、カスパーゼ 322、47、48、49 の活性化を介して、高血糖ストレスを受けたニューロンのアポトーシスを引き起こします。さらに、MAPK シグナル伝達は、慢性疼痛における Ca2+ 透過性の高いチャネルである一過性受容体電位バニロイドサブタイプ 1 (TRPV1) の発現を刺激します 50。これは、熱性痛覚過敏を含むいくつかの糖尿病の合併症を示唆しています51。

DN で観察される代謝変化の複雑さのため、痛みを伴う状態を治療するための薬理学的標的がいくつかありますが、有効性は低いです。ほとんどの患者は症状がいくらか緩和されたと言っていますが、時間の経過とともに、たとえ治療が終了する前であっても症状は後退します52。非熱プロセスとして特徴づけられる光生体調節療法（PBMT）には、赤色および赤外線照射によるシトクロム c オキシダーゼ（CCO; ミトコンドリア複合体 IV）などの特定の細胞発色団の活性化が含まれます53。このプロセスは、光が細胞膜を通過するときに細胞内の光物理学的および光化学反応によって引き起こされ 54、55、56、アデノシン三リン酸 (ATP) の増加、酸素生成、および細胞の生存に関連する特定の経路の調節を引き起こします。一酸化窒素（NO）放出57。その結果、私たちのグループが行った以前の研究で観察されたように、フォトバイオモジュレーションは、少なくとも補完的に、DNを含むいくつかの痛みを伴う状態を治療するための治療法として使用できます66。それに基づいて、この研究は、疾患の経過におけるMAPK経路の役割とPBMTの標的として考慮し、ストレプトゾトシン（STZ）誘発性糖尿病性神経障害に対するPBMT（904 nm）の抗痛覚過敏効果を分析することを目的としました。機構。

低用量の STZ (5 回の低用量、1 日あたり 25 mg/kg の単回投与) による T1D 誘発プロトコルは、不可逆的な高血糖の導入に適していました。 STZ 注射を受けたすべてのラット (STZ および STZ + PBMT グループ) は、5 回の STZ 低用量投与後に高血糖症 (血糖濃度 250 mg/dL 以上、349.07 ± 48.23 mg/dL) になり、4 回目と 4 回目の間で高血糖の閾値に達しました。 5 日目 (図 1A、B)。高血糖ラットは、多尿症、多食症、および多飲症も示した(データは示さず)。実験期間中、彼らは体重の増加を止め、わずかに体重が減少しました（グラム単位）（図1C）。 STZビヒクルであるクエン酸ナトリウム緩衝液（SCB）の全身投与は、対照のナイーブラットと比較して血糖や体重増加に変化を与えなかった。

PBMT は、血糖や体重を変えることなく、T1D ラットの痛覚過敏を減少させます。 (A) 複数回の低用量 STZ による T1D 誘導プロトコール中のラットの朝の平均血糖値 (赤線)。黒い水平点線: 確立された糖尿病閾値 (グルコース ≥ 250 mg/dL)。 (B) STZ (赤線) および STZ + PBMT (緑線) グループのラットは、7、14、21、24、および 28 日目に高レベルの高血糖を示しました。 (C) STZ (赤線) および STZ + PBMT (緑線) グループのラットは、糖尿病の導入後に体重増加が止まりました。 (D) 機械的離脱閾値 (Δ; g; 痛覚過敏の強度) からのデータは、PBMT が STZ グループ (赤線) と比較して STZ + PBMT グループ (緑線) の痛覚過敏の強度を有意に減少させたことを示しています。２４日と２８日です。 (E) 21 日目から 28 日目までの期間中の PBMT の抗痛覚過敏効果を強調した棒グラフ。 (A-C) において、記号 (***) は糖尿病群と対照間の有意差 (p < 0.001) を意味します (二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定)。 (D) および (E) では、記号 (**) および (***) は、STZ グループと STZ + PBMT グループ間の有意差 (それぞれ p < 0.01 および p < 0.001) を意味します (二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニポストホック)テスト）; 記号 (#) は、対照群と比較した STZ 誘発群間の有意差 (p < 0.001) を意味します (二元配置 ANOVA の後にボンフェローニ事後検定 [D]、一元配置 ANOVA の後にボンフェローニ事後検定 [E])。データは平均±SEMとして表されます。黒い垂直点線は PBMT 期間を示します。

STZ は、膵臓ベータ細胞 (β 細胞) を選択的に殺す能力で知られる糖尿病誘発性抗生物質で、ラットの T1D モデルに一般的に使用されます 67、68、69、70。 STZ は、β 細胞のグルコーストランスポーター GLUT2 に取り込まれ、免疫機構を引き起こします 68,69。 Wang および Gleichmann によると、STZ は、神経毒性などの STZ 副作用を少なくすることを目的とした方法である、複数の低用量プロトコールを通じて投与された場合、生体内および生体外での GLUT2 発現を制限します。一般に、STZ 注射を受けたラットはインスリン産生の低下を示し、高血糖を引き起こし、その結果、多飲および多尿を引き起こします70。これらの糖尿病シグナルはすべて、低用量 STZ プロトコールを受けたラット (STZ および STZ + PBMT グループ) で観察され、したがって、私たちのグループの以前の研究で示されているように、糖尿病誘発の再現可能なモデルを特徴づけています 66,71,72,73,74 。

糖尿病ラットは、PBMT の有無にかかわらず (それぞれ STZ + PBMT および STZ グループ)、実験プロトコールの 21、24、および 28 日目に同様のレベルの高血糖を示しました (454.94 ± 37.10 mg/dL)。ラットの体重に関しても同じことが観察されましたが、かつてはこのパラメータが PBMT ではなく糖尿病の状態にのみ依存していました。同様に、図 1B、C に示すように、PBMT は健康なラット (対照、非糖尿病および非痛覚過敏; SCB + PBMT グループ) に対して影響を与えませんでした。我々の結果は、Peplowらによって行われた研究75と裏付けられており、糖尿病患者の創傷治癒に適用されたPBMT（660 nm、100 mW、4.7～6.3 J/cm2、20秒）は、高血糖や患者の代謝状態に変化を与えなかったという。。

データは、私たちの研究グループから得られた以前の結果を再現しました66。２１日目（最初のＰＢＭＴセッション後）には、機械的痛覚過敏の強度（Δ離脱閾値、ｇ）の減少はなかった。しかし、24 日目と 28 日目には、STZ 群と比較して STZ + PBMT 群の痛覚過敏の強度の時間的に有意な減少 (それぞれ p < 0.01 および p < 0.001) が観察されました。それにもかかわらず、図1D、Eに示すように、PBMTを対照ラット（SCB + PBMTグループ）に適用した場合、SCB（ビヒクル）グループとナイーブグループで観察された同様の条件で機械的離脱閾値に変化はありませんでした（最新の）詳細については PBMT 期間について説明します)。

PBMT は神経障害性疼痛の臨床治療に長い間使用されており、満足のいく結果が得られています 76,77 が、その鎮痛機構は完全には理解されていません。赤外光によるニューロンの活動亢進の抑制は、PBMT がニューロンに直接作用し、その結果として痛みの結果に直接作用する方法の 1 つであると考えられます。腰痛患者が L4-L5 レベルで PBMT (808 nm; 100 mW; 8.4 J; 84 秒; 1 回のセッション) を受けると、有意な痛みの軽減が見られるため、神経調節効果が示唆されています 52,80。この調節効果は、高血糖によって影響を受けるニューロン活動を調節して、痛みを伴う感覚を回避する鍵となる可能性があります。

私たちの分析は、STZ 誘発 DN74 に関連する動的運動機能の変化を特定した以前の研究に基づいていました。図2A、Bに示すように、PBMTは、4回（24日目）および8回（28日目）のPBMTセッション後に、ラットの後足の最大接触面積（cm2）および印刷面積（cm2）を改善できました。おそらく、これらのデータは、鎮痛の改善により神経伝導が改善されるはずであることを示唆しています。このような期間では、STZ + PBMT グループと STZ グループの間で統計的な差異が観察されました。しかし、両方の神経障害群（STZ および STZ + PBMT）と対照群（ナイーブ、SCB、および SCB + PBMT）の間を除いて、歩幅（cm）パラメータ（図 2C）には差は観察されませんでした。 24日目と28日目のSTZ + PBMTグループのラットの右後足（RH）の足跡では、指と足底パッド（無毛）の領域が明確に区切られているように見えました（図2D：e）。ナイーブおよび SCB グループで観察され (図 2D: a、b、d)、したがって STZ グループ (図 2D: c) とは異なります。最新の調査では、28 日目の足跡の解像度が低く、接触面積が減少していることが示されました。

歩行空間パラメータは DN で変化し、PBMT によって妨げられました。 (A) 最大接触面積 (cm2)。 (B) 印刷領域 (cm2)。 (C) 歩幅 (cm)。データは平均±SEMとして表されます。記号 (*) および (***) は、STZ グループと STZ + PBMT グループ間の有意差 (それぞれ p < 0.05 および p < 0.001) を意味します。記号 (#) は、対照群 (ナイーブ; SCB; SCB + PBMT) と比較した STZ 誘発群 (STZ および STZ + PBMT) 間の有意差 (p < 0.001) を意味します。二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定。 (D) 後足の 2D 足跡の一般的なパターン。 STZ グループ (c) のラットは、白い点線で区切られ、赤い矢印で示された接触面積の減少を示しました。 STZ + PBMT グループのラット (e) は、コントロールグループ (赤い矢印) に最も近いフットプリント領域を示しました。右下のフレーム (f) では、体軸は、分析中に足の位置を観察するための基準として機能します。

Zochodne et al.81 によると、糖尿病がコントロールされていないと、運動ニューロンが関与する前に感覚ニューロンの損傷が引き起こされます。 DN は、歩行中の足の位置の変化 82 や立位段階全体で加えられる圧力の変化 83,84 など、このプロセスにおける姿勢の変化に関連しています。私たちのグループは、最大強度 (au) が STZ 注射開始後 14 日目の主な変化パラメーターであることを実証しました 74。これは、他のグループによる以前の結果 84 と一致します。 14日目に機械的閾値の低下を示した糖尿病動物は、足がCatWalk XTシステムのガラス床に接触する際に加える圧力が減少した。これらの発見は、機能を損なう手足の末端の感覚障害として発生する、「ストッキングとグローブ」としても知られるDNの感覚変化のパターンに従っています2,85。

主に CatWalk XT システムを使用した場合に、動物モデルの運動パラメーターに対する PBMT の影響を評価した研究はほとんどありません。ヘビ毒による局所筋壊死は、毒注射から 3 時間後に影響を受けた後肢に半屈曲姿勢を引き起こします。ただし、GaAs レーザー (904 nm、4 J/cm2) を使用して同じ周期で適用された PBMT は、最大強度 (ua)、スタンド (s)、およびバランス (s) をコントロール 60 と同様の値に戻します。高血糖ラットは後肢の半屈曲を示さなかったが、歩行中に加える圧力は弱かった（強度が低く、足の接触面積が小さいことで表される）。したがって、PBMT は、この治療法によって促進された抗痛覚過敏効果の結果として、高血糖ラットの歩行の変化を少なくとも部分的に正常化する可能性があります。総合すると、糖尿病由来の神経因性疼痛は感覚ニューロンと運動ニューロンの障害に起因する可能性が高いと示唆するのがもっともらしいです。

PBMT の抗痛覚過敏効果が DRG におけるサイトカインの減少と関連しているかどうかをさらに調べるために、ELISA イムノアッセイによって TNF-α、IL-1β、IL-6、CINC-1、および IL-10 の濃度を分析しました。図 3B、E に示すように、高血糖は IL-1β および IL-10 のレベルをそれぞれ増加させましたが、TNF-α、IL-6、および CINC-1 には影響を与えませんでした（パネル A、C、および D、それぞれ）。しかし、PBMT は高血糖とは無関係に、分析されたすべてのサイトカインを減少させました (図 3)。我々の発見と一致して、高血糖は、DRG10における炎症誘発性サイトカインIL-1βおよび抗炎症性サイトカインIL-10のレベルを特に上昇させる。また、TNF-α、IL-6、および CINC-1 のレベルは高血糖の影響を受けず、DN に純粋な炎症性の背景があることが示唆されました。それにもかかわらず、この研究では、多形核細胞遊走などの他の炎症パラメーターは分析されていません。しかし、この研究のデータは、PBMT が高血糖によって増加したサイトカインを含む DRG のサイトカインのレベルを低下させることを実証しました。

TNF-α、IL-1β、IL-6、CINC-1、およびIL-10のDRGレベルに対するPBMTの効果。 (A) STZ グループ (赤色の記号) では TNF-α レベル (pg/mL) の増加はありませんでした。 STZ + PBMT グループ (緑色の記号) は、他のすべてのグループと比較して、TNF-α レベル (pg/mL) の有意な低下を示しました。 (B) IL-1β レベル (pg/mL) については、他のすべてのグループと比較して、STZ グループ (赤色の記号) で有意な増加が見られました。 (C) IL-6 のレベル (pg/mL) は、他のすべてのグループと比較して、SCB + PBMT (青色の記号) および STZ + PBMT (緑色の記号) グループで有意に減少しました。 (D) CINC-1 濃度 (pg/mL) は、SCB + PBMT グループ (青色の記号) のみで有意な減少を示しました。 (E) IL-10 のレベル (pg/mL/mg) は、他のすべてのグループと比較して STZ グループ (赤色の記号) で有意な増加を示しました。データは平均±SEMとして表されます。記号 (*) および (**) は、それぞれ p < 0.05 および p < 0.01 を意味します。記号 (#) は、すべての対照群が STZ 群と有意に異なることを意味します (p < 0.05)。一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定。

神経障害性疼痛の病態生理学は各神経障害の種類によって異なりますが、坐骨神経によって引き起こされる痛覚過敏における PBMT (660 nm; 30 mW; 9 J/cm2; 60 秒; 連続 7 日間; 63 J/cm2 累積エネルギー密度) の使用収縮モデルは、TNF-α、IL-1β、HIF-1α（低酸素誘導因子-1α）などの炎症誘発性サイトカインの減少を引き起こします86。同様に、坐骨神経挫滅損傷のマウスモデルにおける PBMT (950 nm; 2.5 J/cm2; 32 秒; 連続 15 日間; 37.5 J/cm2 累積エネルギー密度) による TNF-α レベルの低下が報告されました 87。これらの証拠の断片は、PBMT の抗炎症能力を示唆しています。この点に関して、PBMTによって促進される抗炎症効果は、660 nmと684 nmの両方の低レベルレーザー（30 mW、7.5 J/cm2、196秒、単一点）を用いたカラギナン誘発炎症モデルで以前に観察されています。 ) カラギーナン注射後 4 時間で浮腫形成と炎症細胞遊走が減少しました 88。

炎症性サイトカインは、さまざまな細胞膜受容体を活性化して環境シグナルを伝達することができ、いくつかの細胞株では、G タンパク質共役受容体 (GPCR) および受容体チロシンキナーゼ (RTK) の活性化によって MAPK が活性化されます 89。 MAPK カスケードシグナル伝達は、さまざまな細胞外刺激に応答した細胞内シグナル伝達に関連する進化的に保存された経路です90。 MAPK は、成長、増殖、分化、運動性、ストレス応答、生存、アポトーシスなどの多くの細胞プロセスを制御します 91。 MAPK の 3 つのグループ (p38、ERK1/2、JNK) はすべて、グルコース、ポリオール経路、酸化ストレス、終末糖化産物 (AGE) に由来する浸透圧摂動によって活性化されます 92。これらの出来事は、DN1 の病因に深く関与しています。

炎症とMAPK経路の間の可能性のある相互作用を調べるために、制御されていない糖尿病によって引き起こされる状態によりこれらの分子標的がDNで変化すると考えられる場合、L4-L5 DRGにおけるMAPKの遺伝子およびタンパク質の発現をさらに評価しました92。リアルタイム定量的 PCR 実験の前に、ターゲット遺伝子 (p38、ERK1/2、および JNK) およびハウスキーピング遺伝子 (内因性コントロール: Arfgef1 および Serpinb6) のプライマーの有効性を標準曲線の作成によってテストしました。これは、ナイーブ cDNA の段階希釈 (1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64) および固定プライマー濃度 (100 nM) によって行われました。内在性対照（99.9; r2 0.98）を含む、試験したすべてのプライマーで高い効率が観察されました（データは示さず）。次に、標的遺伝子の発現を、Arfgef1 および Serpinb6 遺伝子発現のプールからの Ct (サイクル閾値) の平均値によって正規化しました。

この研究では、ナイーブ、SCB (溶媒) (p < 0.01)、および SCB + PBMT グループ (p < 0.001; 対応のない Student t 検定) と比較して、STZ グループで p38 mRNA の発現の有意な増加が観察されました。さらに、図４Ａに示すように、ＳＴＺ群におけるｐ３８ｍＲＮＡ発現は、ＳＴＺ＋ＰＢＭＴ群と比較して有意に高かった（ｐ＜０．０５；対応のないスチューデントｔ検定）。 PBMT が血糖を改善しない場合、我々は、この効果は痛覚過敏に関連しており、STZ グループでのみ明らかであると結論付けます。 STZ + PBMT、SCB、およびナイーブの各グループ間で p38 mRNA の差異は観察されませんでした。 ERK1/2 および JNK mRNA 発現に関するグループ間のわずかな差は有意ではありませんでした (図 4B、C)。

MAPK mRNA の定量的発現。 p38 (A)、ERK1/2 (B)、および JNK (C) の遺伝子発現値は、内因性対照 (Arfgef1 および Serpinb6) 発現のプールによって指数正規化されました。 PBMT は、痛覚過敏ラット (STZ + PBMT グループ) における p38 mRNA 発現を減少させました。高血糖は、痛覚過敏に関連する DRG における p38 mRNA 発現を増加させましたが、ERK1/2 および JNK は増加させませんでした。データは平均±SEMとして表されます。記号 (*)、(**)、および (***) は、STZ (赤色の記号) と他のグループ (ナイーブ、黒色の記号) との比較において、(それぞれ) p < 0.05、p < 0.01、および p < 0.001 を意味します。 ; SCB、灰色のシンボル; SCB + PBMT、青色のシンボル; STZ + PBMT、緑色のシンボル); 対応のない Student t 検定。

免疫蛍光（IF）実験でも、STZグループでは活性化MAPK、特にp-p38の発現がより高い増加を示した（図5H、I）。 STZ + PBMT グループに示されているように、痛覚過敏ラットにおける p-38 リン酸化に関する蛍光は、DRG 領域に PBMT を適用することによって減少しました。このグループでは、一部の p-38 活性化が存在しましたが、ニューロンの数は減少しました。 STZグループとの比較（図5K、L）。 STZおよびSTZ + PBMTグループの両方について、DAPI共染色によって示されるように、p38の活性化はDRG求心性ニューロンの核に高度に集中していました（詳細は図5I、L）。 STZ + PBMT グループでは p-p38 陽性ニューロンの数が少ないことに加えて、いくつかの小胞様立体構造を持つニューロンの細胞質に散乱されたより高い強度の蛍光を観察することもできました (詳細は図 5K、L)。しかし、痛覚過敏の非PBMTラット(STZ群)と比較したこの差異の意味は不明である。

共焦点顕微鏡によるp-p38 MAPKのDRG組織顕微鏡写真。厚さ 14 μm の DRG 横断切片を、Thr180 および Tyr182 (B、E、H、K) における内因性 p38 リン酸化を染色するための IF プロトコールに供しました。核染色用の DAPI を (A、D、G、J) に示します。マージ (DAPI + p-p38) 画像も (C、F、I、L) に表示されます。 (H) と (K) では、白い矢印はズームインされた領域を指します。詳細は(H,I,K,L)の左隅に表示されます。倍率: ×40; スケールバー: 50 μm。

遺伝子発現結果と同様に、ERK1/2 タンパク質の低リン酸化が検出されました。ただし、SCB + PBMT グループと STZ + PBMT グループの両方 (それぞれ図 6E、K) では、蛍光関連 p-ERK1/2 活性化のレベルは、SCB グループおよび STZ グループと比較してさらに低かった (図 6B、H) 、それぞれ）。 STZ + PBMT グループに関する興味深い観察は、図 6K、L (詳細) に示すように、細胞膜の近傍に発生した p-ERK1/2 の存在です。

共焦点顕微鏡によるp-ERK1/2 MAPKのDRG組織顕微鏡写真。厚さ 14 μm の DRG 横断切片を、Thr202 および Tyr204 (p44/p42) における ERK1/2 リン酸化を染色するための IF プロトコールに提出しました (B、E、H、K)。核染色用の DAPI を (A、D、G、J) に示します。マージ (DAPI + p-ERK1/2) の画像も (C、F、I、L) に示します。 (H) と (K) では、白い矢印はズームインされた領域を指します。詳細は(H,I,K,L)の左隅に表示されます。倍率: ×40; スケールバー: 50 μm。

ERK1/2 リン酸化と一致して、DRG 領域に PBMT を適用すると、痛覚過敏とは独立して p-JNK 発現が減少します (SCB + PBMT および STZ + PBMT グループ; それぞれ図 7E、K)。 PBMTに従わなかったラットは、p-JNKの基礎的な発現を示し、細胞質内に拡散して観察された（SCBおよびSTZグループ；それぞれ図7B、H）。

共焦点顕微鏡によるp-JNK MAPKのDRG組織顕微鏡写真。 DRG 横断切片は厚さ 14 μm で、Thr183 および Tyr185 (p46/p54) における内因性 p-JNK リン酸化の染色のための IF プロトコールに供されました (B、E、H、K)。核染色用の DAPI を (A、D、G、J) に示します。マージ (DAPI + p-JNK) 画像も (C、F、I、L) に示されています。 (B) および (H) では、矢印は細胞質内の拡散染色を示します。倍率: ×40; スケールバー: 50 μm。

MAPK の活性化が、さまざまな疾患状態における異痛症および痛覚過敏に関連していることが証明されています 93、94、95。 MAPK ファミリーの中で最も研究されているメンバーである p38-MAPK は、通常、細胞外ストレスと炎症誘発性サイトカインによって活性化され、p38 薬理学的阻害剤の全身投与後に炎症が大幅に軽減されると、炎症プロセスにおいて顕著な役割を果たします96。ラットは、STZ 処理後 8 ～ 12 週間までに、L4 ～ L5 DRG で p38、JNK、および ERK1/2 の活性化を示しましたが、JNK の活性化は p38 および ERK1/241 に比べて遅れていました。 TNF-α と IL-1β は、末梢神経損傷後の疼痛状態の発症と維持に重要な役割を果たしていることが示唆されています 97。 p38 が DRG における TNF-α および IL-1β 生合成を調節すると、両方の減少が鎮痛における正の反射を伴う抗炎症効果に達する可能性があります 97。したがって、我々のデータは、細胞事象の光物理学的および光化学的エフェクターであるPBMTが、p38の活性化（リン酸化）の減少に関連するTNF-αおよびIL-1βの減少を促進することを示しており、これは治療の鎮痛効果の説明に役立つ可能性がある。

私たちのデータは、PBMTによるMAPK活性化のわずかな減少を示しましたが、骨格筋細胞の組織培養で研究されたレーザー療法（He-Ne; 632.8 nm; 4.5 mW; 各1.8 mm × 1.8 mm平方で3秒）は、 ERK1/2 の増加、p38 および JNK 発現には影響なし 98。また、骨芽細胞培養物におけるレーザー照射 (Er: YAG; 2.94 μm; フルエンス 0.7 ～ 17.2 J/cm2) は、ERK1/2 の活性化を示しましたが、p38 および JNK の発現には影響を与えません 99。したがって、MAPK の発現に対する PBMT の効果は、この治療に関与する組織に依存する可能性があります。

DRG における p38 の活性化は、炎症時などに末梢組織から放出される神経成長因子 (NGF) の逆行性輸送によって開始されることが示唆されています。 TRPV1 (多峰性受容体チャネル) の末梢侵害受容器末端への翻訳と輸送を増加させ、熱痛感受性の維持に貢献します。さらに、p-p38 は主に DRG の小さなニューロンで見つかり、C 型感覚線維の活性化が高いことを示唆しています 100。

DRG における p-p38 の IF 染色と相補的に、その発現が特定の種類の神経線維、すなわち C 型線維 (小さな DRG ニューロン、無髄、TRPV1+) に関与しているかどうかをさらに分析しました。 TRPV1+ 線維は、すべての実験グループの DRG 切片で検出されました。それらはタイプCとして分類され、STZおよびSTZ + PBMTグループでより高い蛍光強度と発生率を示しました（それぞれ図8K、O）。 p-p38 および TRPV1+ 線維の共染色は広範囲に分布しており (それぞれ図 8L、P)、図に示すように、STZ + PBMT グループでは TRPV1+ シグナル (赤) が p-p38 (緑) よりも優勢でした。図８Ｐ（詳細）。

共焦点顕微鏡によるp-p38 MAPKのDRG組織顕微鏡写真およびTRPV1の共染色。 DRG 横断切片を 14 μm の厚さで作成し、Thr180 および Tyr182 (B、F、J、N) および TRPV1 (C、G、K、O) における内因性 p38 リン酸化を染色するための IF プロトコールに供しました。核染色用の DAPI を (A、E、I、M) に示します。マージ (DAPI + p-p38 + TRPV1) 画像も (D、H、L、P) に表示されます。 STZ + PBMT グループは、p-p38 MAPK については中程度の染色 (N; 白矢印)、TRPV1 については染色の増加 (O; 白矢印) を示しました。詳細は(L)、(P)の左隅に記載されています。倍率: ×40; スケールバー: 50 μm。

TRPV1 を介した Ca2+ 流入が ATP 放出、P2Y2 プリン作動性受容体活性化、および上皮成長因子受容体 (EGFR) のトランス活性化を引き起こすため、TRPV1 と MAPK の間には相関関係があります。 [Ca2+]i の増加と ATP の P2Y2 への結合により、ホスホリパーゼ C (PLC) を介して細胞内 IP3 が上方制御されることが記載されています。 IP3 の上方制御は、ストア作動性チャネル (SOC) の開口をもたらし、小胞体 (ER) からの Ca2+ 放出を引き起こします。以前の TRPV1 媒介 EGFR トランス活性化は、Ras/Raf/MAPK シグナル伝達を促進します 101。

皮膚組織は TRPV1+ 侵害受容神経終末によって神経支配されており 102、日光に容易にさらされ、紫外線 (UV) 光によって活性化されます。 UV 光は、不死化ヒトケラチノサイト (HaCaT 細胞) における Ca2+ 流入と非選択的カチオン電流を活性化します 103。この活性化は TRPV1 アンタゴニストであるカプサゼピンによって抑制されたため、光と TRPV1 チャネル間の相互作用が示されました 103。この意味で、Wang et al.104 は、980 nm レーザー装置 (3 J/cm2; 連続波) による PBMT が熱効果を誘導し、その結果、脂肪由来幹細胞における TRPV1 活性化を誘導することを示しました。 DRGからの我々のデータは、PBMTが糖尿病性痛覚過敏ラットにおけるTRPV1の発現を増加させるが、後述するように、PBMTはDRGニューロン培養におけるCa2+流入を減少させることを示唆した。ただし、高血糖ラットの DRG 領域に適用された PBMT の抗痛覚過敏効果における TRPV1 の関与をより詳しく調査するには、さらなる研究を行う必要があります。

MAPK 経路の活性化と PBMT によるその調節は、DRG ニューロンにおける Ca2+ 動態に関連していると思われます。 FLUO-4 AM染色したDRGニューロンの蛍光強度の増加は、すべてのグループについて15 mM KCl、特に50 mM KClによる刺激後に観察された(図9A)。注目すべきことに、15 mM KCl刺激後のΔ[Ca2+]iに関する蛍光の増加は、高血糖培地（高グルコースグループ）で事前に維持されたニューロンで主に観察されました（図9B、C）。対照的に、高血糖培地（55 mM グルコース）中に維持され、PBMT に曝露された DRG ニューロン（高グルコース + PBMT グループ）は、高血糖培地と比較して、15 mM KCl 刺激中に蛍光強度の有意な（p < 0.001）減少を示しました。グルコース基(図9B、C)。反応性ニューロンにおける Ca2+ 流入の刺激の対照として使用した 50 mM KCl 刺激中に、低グルコース + 群と比較した低グルコース群の蛍光強度の間に主な差 (p < 0.05) が観察されました。 PBMT グループ (図 9D、E)。 50 mM KCl 刺激が停止すると、両方の高血糖グループで蛍光強度が減少しましたが、基底レベルには戻りませんでした (図 9D、E)。

PBMT は、高血糖によって増加した DRG ニューロンのカルシウム動態を減少させます。蛍光強度（ΔF = F − F0/F0）は、低グルコース（黒線）または高グルコース（赤線）培地で24時間培養し、試験直前にPBMT（緑および青線）に曝露したDRGニューロンで分析されました。。 (A) 5 mM (基本)、15 mM (中間)、および 50 mM (高) KCl による細胞外刺激後の蛍光強度 (ΔF = F − F0/F0) の一般的な表示。 ↑[K+]e を使用して、FLUO-4 AM とインキュベートした DRG ニューロンに Ca2+ 流入を生成しました。 (B) 中間刺激 (15 mM KCl) 中に、高グルコース群と高グルコース + PBMT グループを比較すると、ΔF に有意な差がありました (比較は水平の点線で区切られたΔF を考慮して行われました)。二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定。 (C) 15 mM KCl による刺激直後のタイムラプス中の DRG 細胞培養のスナップ撮影画像。 (D) 高刺激 (50 mM KCl) では、低グルコース群と低グルコース + PBMT グループの間に有意な差がありました。 (E) 50 mM KCl による刺激直後のタイムラプス中の DRG 細胞培養のスナップ取得画像。 (F) 15 mM 刺激中の応答細胞の割合 (%)。高グルコース群では、すべての反応細胞の約 60%、つまり 50 mM KCl 刺激中に蛍光が増加した細胞 (陽性対照) が中間刺激 (15 mM KCl) にも反応し、他の細胞とは統計的に異なりました。グループ。データは平均±SEMとして表されます。記号 (*) および (***) は、高グルコース群と比較して、それぞれ p < 0.05 および p < 0.001 を意味します。一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定。

蛍光強度 (Δ[Ca2+]i) 以外に、50 mM KCl に応答するニューロンの総数に対する 15 mM KCl 応答細胞の割合 (%) も定量しました (図 9F)。 15 mM KCl 刺激に反応するニューロンの割合は、低グルコース (p < 0.001) および高グルコース + PBMT グループ (p < 0.05) と比較して、高グルコースグループの方が高かった。このデータは、PBMT が高血糖によって増加した DRG ニューロンの応答性を低下させることを示唆しています。したがって、DRG 領域における PBMT の考えられる鎮痛機構の 1 つは、同時に、IL-1β 誘導 p38 MAPK を介して DRG ニューロンにおける TRPV1 発現を増加させ、Ca2+ の減少により TRPV1+ ニューロンを脱感作することであるという仮説はもっともらしいです。流入。

PBMTは、糖尿病性神経障害性痛覚過敏を治療するための新しい治療アプローチとなる可能性がある。これは、MAPK経路とカルシウム動態によって支配される、このような疾患で観察される機能的、分子的、細胞的変化に対する有益な光物理学的および光化学的効果に基づいている。

すべての実験は動物使用倫理委員会 (CEUA/UNICAMP、許可番号 5337-1/2019) によって承認され、ARRIVE ガイドラインに従いました。実験は、ブラジル国家動物実験管理評議会（CONCEA）およびブラジル動物実験大学（COBEA）のガイドラインに従っても実施されました。大学の学際的生物学研究センター (CEMIB) から提供された、生後 4 ～ 8 週、体重 200 ～ 250 g の雄のルイスラット (LEW/HsdUnib、ハーラン、米国、1996 年) を使用しました。ラットは、12℃以下の温度と湿度に管理された部屋で、おがくず床（週に3回交換）を備えたプラスチックケージで1ケージあたり約4匹飼育し、餌（げっ歯類用の市販の餌）と濾過水を自由に与えました。 12時間の暗/明サイクル。

ラットを、1 グループあたり 8 匹のラット (n = 8) からなる 5 つの実験グループにランダムに分けました。ＳＣＢ（ビヒクル、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液を５回投与され、ＰＢＭＴは投与されなかった）； STZ（1回あたり25 mg/kgのSTZを5回投与、PBMTは受けなかった）。 SCB + PBMT (ビヒクルを 5 回投与され、PBMT に提出された); STZ + PBMT (STZ を 5 回投与され、PBMT に提出された)。ネズミの数とその苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。

T1D の誘発は、低用量の STZ (25 mg/kg) (N-[メチルニトロソカルバモイル]-α-d-グルコサミン; Sigma- Aldrich®、セントルイス、ミズーリ州、米国]）をビヒクル（0.1 M クエン酸ナトリウム緩衝液、SCB [pH 4.5]）で希釈し、1 日 1 回、連続 5 日間腹腔内（ip）注射しました（STZ および STZ + PBMTグループ）。コントロール動物（SCB および SCB + PBMT グループ）には、ラットの体重に応じて 50 ～ 62.5 μL の範囲の同量のビヒクルを毎日注射しました。尾静脈からの血糖測定は、Accu-Chek® Sensor Comfort (Roche Diagnostics®、ドイツ) を使用して実行されました。高血糖の進行およびラットの体重を、ＳＴＺまたはビヒクル注射の開始後０日目、７日目、１４日目、２１日目、２４日目、および２８日目にモニタリングした。

痛覚過敏は、電子的 von Frey テスト (Insight®、リベイロンプレト、SP、ブラジル) を適用することによって決定された機械的離脱閾値によって測定されました。我々は、左右のラットの後足の足底表面に三日月型の圧力を加える手持ち式力変換器に適合したポリプロピレン製ピペットチップを使用した。この装置は、足が引っ込められると、足の足底中央表面にかかる圧力を自動的にグラム力 (g) に変換します。ラットを金属メッシュの床を備えた個別のプラスチックケージにランダムに入れ、試験前に 30 分間順応させた。 STZ またはビヒクル注射開始後 0、7、14、21、24、および 28 日目に、常に午前中に電子フォンフライ検査をすべての実験群に、群と治療に対する盲検検査官によって適用しました。 STZ + PBMT グループについては、PBMT 曝露の対象となる痛覚過敏ラットのみを選択するために、STZ 注射を開始してから 19 日後に追加の分析を実施しました。

CatWalk ウォーキングトラックテスト (オランダ、ヴァーヘニンゲンの Noldus Inc.) は、広角レンズを備えた高速ビデオカメラ (Gevicam GP-3360; GEViCAM Inc.、カリフォルニア州ミルピタスにある GEViCAM Inc.) を備えた照明付き歩道ガラス床で構成されています。 (6.0 mm; DF6HA-1B、Fujinon Corp.、中国)。カメラは通路の下 56 cm に設置され、CatWalk™ XT 10.6 ソフトウェアは、動物が長さ 20 × 10 cm の目盛り付き通路を横切るときに足跡を自動的に記録しました。緑色の LED と赤色に照らされた背景が、動物の歩みに応じてガラスの床にコントラストを生み出します。 CatWalk XT 構成は、Vieira et al.74 が使用したパラメータに従ってセットアップされました。現在の研究では、最大接触面積 (cm2)、印刷面積 (cm2)、および歩幅 (cm) に関する後足 (右後足 [RH] と左後足 [LH]) の平均を考慮しました。 STZ またはビヒクル注射の開始後 0、7、14、21、24、および 28 日目に、常に午後に部屋の照明を消して分析しました。各ラットは分析期間ごとに 3 回の実行を実行したため、各期間ごとにグループごとに 24 回の実行が完了しました。

SCB + PBMT および STZ + PBMT グループのラットに、8 日間 (STZ またはビヒクル注射後 21 日目から 28 日目まで)、1 日 1 回、常に午前中に PBMT を与えました。 STZ + PBMT グループの場合、我々の DN モデルでは STZ 注射を受けたラットの約 20% が痛覚過敏にならなかったので (データは示さず)、痛覚過敏ラットのみがレーザー治療を受けると考えられました。ＰＢＭＴは、ＥｎｄｏｐｈｏｔｏｎＬＬＴ１３０７（ＫＬＤＢｉｏｓｉｓｔｅｍａｓＥｑｕｉｐ．Ｅｌｅｔ．Ｌｔｄａ（登録商標）、Ａｍｐａｒｏ、ＳＰ、ブラジル）クラスＩＩＩＢレーザー装置を用いて実施した。ラットをイソフルラン (3%) (Cristália®、イタピラ、SP、ブラジル) で麻酔し、L4 ～ L5 脊椎レベルの間の単一点でラット背部の剃毛皮膚に両側からレーザー照射を直接適用しました。 PBMT パラメータを表 1 に示します。

炎症性サイトカインのレベルと MAPK 遺伝子発現を分析するために、ラットをイソフルラン (3%) (Cristália®) で麻酔し、人道的に安楽死させました。解剖後、L4 および L5 DRG を収集し、液体窒素 (-196.15 °C) で瞬間凍結し、後部の均質化のために -80 °C で保存しました。 ELISA イムノアッセイ用の DRG サンプルに、オルトバナジン酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤、および PMSF (フッ化フェニルメタンスルホニル) (Thermo Scientific™) を含む RIPA 溶解および抽出バッファー (Thermo Scientific™、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を添加しました。サンプルを FastPrep® ホモジナイザー (MP Biomedicals™、米国カリフォルニア州サンタアナ) に置き、5 分間隔で 4 °C (5 × 20 秒) で振盪しました。その後、均質化した DRG を 4 °C で 3 時間連続撹拌し、その後 4 °C で 12,000 rpm で 15 分間遠心分離しました。得られた上清を新しいチューブに移した。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによって測定されました105。

リアルタイム RT-qPCR による MAPK 遺伝子発現では、製造元の指示に従って、DRG を断片化し、TRIzol® (Invitrogen Life Technologies™、米国カリフォルニア州カールズバッド) (1 mL/mg) でホモジナイズし、全 RNA を単離しました。ホモジネートにクロロホルム (Sigma-Aldrich®) 0.2 mL を加え、室温で 3 分間静置した後、12,000 rpm、4 °C で 15 分間遠心分離しました。水相を新しいチューブに移し、そこにイソプロパノール０．５ｍＬを加えた。再度遠心分離した後、ペレットを 75% エタノールで洗浄し、全 RNA を UltraPure™ DEPC 処理水 (Thermo Scientific™) に再懸濁しました。総 DRG RNA は、超低容量分光光度計 (Epoch Microplate Spectrometer、BioTek Instruments Inc.、Winooski、VT、USA) を使用して定量しました。

DRG 免疫蛍光 (IF) では、ラットをケタミン (85 mg/kg、腹腔内) およびキシラジン (10 mg/kg、腹腔内) で麻酔し、次に生理食塩水 (0.9% NaCl、 200mL）。放血後、ラットに 4% パラホルムアルデヒド (PFA、pH 7.4、4 ℃、300 mL) を灌流しました。次に、L4 および L5 DRG を収集し、4% PFA 中で 4 °C で一晩後固定し、続いて 30% スクロース中で 4 °C で 48 時間後固定しました。個々の DRG を Tissue-Tek® OCT コンパウンド (Sakura® Finetek、カリフォルニア州、米国) に包埋し、ゼラチン化スライドを使用してクライオスタット (Leica Biosystems、Wetzlar、ドイツ) 上で 14 µm の非連続切片を作成しました。

IL-1β、TNF-α、IL-6、および CINC-1 については、DuoSet® ELISA キット (R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州、米国) を介して 96 ウェルプレートを使用し、結果は 1 ミリリットルあたりのピコグラムで表されました。 (pg/mL)。 IL-10 については、RayBio® Rat IL-10 ELISA キット (#ELR-IL10) (RayBiotech、ピーチツリーコーナーズ、ジョージア州、米国) を通じて濃度を測定し、結果をピコグラム/ミリリットル/ミリグラム (pg/組織のmL/mg）。両方の ELISA キットについては製造元の指示に従いました。 Asys UVM 340 マイクロプレートリーダー (Biochrom Ltd.、ケンブリッジ、英国) を使用して 450 nm で吸光度を測定し、結果は光学濃度を標準曲線濃度と比較することによって得られました。

L4 および L5 DRG から抽出した 500 ng の全 RNA を、メーカーのプロトコールに従って cDNA 合成 (SuperScript™ VILO™ cDNA 合成キット、Invitrogen Life Technologies™) に供しました。 p38、ERK1/2、JNK、Arfgef1、および Serpinb6 遺伝子に特異的なプライマーは、NCBI/Primer-blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/) で入手可能な「Pick Primers」ツールを使用して設計されました。プライマーブラスト）および商業的に合成されました。アンプリコンは 200 塩基対未満に設定され、ダイマー、クロスダイマー、ヘアピンはプライマー設計中に削除されました (または最小限に抑えられました)。プライマー配列を表 2 に示します。アニーリング温度は 60 °C に設定し、GC (グアニン-シトシン) 含有量は 50 ～ 55% でした。

2-ΔΔCt 法 106 は、内部対照インデックスに対する相対的な遺伝子発現解析を実行しました。反応は、蛍光シグナルとして SYBR Green (Power SYBR™ Green PCR Master Mix、Applied Biosystems、米国) と 1:10 の各サンプルから得られた cDNA。

DRG 切片を 0.1 M グリシン中で 30 分間インキュベートし、その後 2% ウシ血清アルブミン (BSA) で遮断し、0.2% Triton X-100 中で室温で 1 時間透過処理しました。抗リン酸 p44/42 MAPK (ERK 1/2) および抗リン酸 SAPK/JNK の場合、2% BSA ブロッキングの前に、-20 °C でのメタノール 100% 透過処理からなる追加のステップを実行しました。次に、切片を、0.1% Triton-100 および 1% BSA を加えた 0.1 M PBS 中で、湿潤雰囲気下、4 °C で、特異的一次抗体とともに一晩インキュベートしました。以下の抗体を使用しました:抗リン酸 p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (D3F9) XP® Rabbit mAb (1:500)。抗リン酸 p44/42 MAPK (ERK 1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb (1:200)。および抗ホスホ-SAPK/JNK (Th183/Tyr185) (G9) マウス mAb (1:400)、すべて Cell Signaling Technology® (Danvers、MA、USA) 製。インキュベーション期間後、切片を同じインキュベーション溶液（抗体を含まない）で２回洗浄し、次いで０．１ＭＰＢＳで各回５分間、５回洗浄した。次に、同じ一次抗体溶液で希釈した二次抗体 (ロバ抗ウサギまたは抗マウス Alexa 488、1:1000、#A21206、Thermo Scientific™) とともに切片を室温で 1 時間インキュベートしました。インキュベーション後、DRG 切片を 0.1 M PBS で 5 分間、5 回洗浄しました。

核を 0.1 M PBS で希釈した 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI、0.25 μg/mL、D9542、Sigma-Aldrich®) で室温で 10 分間染色し、Vectashield® ( Vector Laboratories、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）。非特異的結合を確認するために、一次抗体中でインキュベートせずにネガティブコントロールを調製しました。スライドは、最初に、DFC360 FX カメラとライカ蛍光光源 CTR7000HS (ライカマイクロシステムズ) を組み合わせた落射蛍光倒立ライカ DMi6000 B 顕微鏡で検査されました。陽性の蛍光を確認した後、EC Plan-Neofluar 20x/0.50 Dry およびEC Plan-Neofluar 40x/1.30 オイル DIC 対物レンズ。

DRG ニューロンの初代細胞培養は、Linhart et al.107 によって記載されたプロトコールに従って実行され、Manzo et al.108 および do Prado et al.73 によって発表されたように、我々の研究グループによって修正されました。体重約２００ｇ、生後４週間の健康な雄ルイスラット（ＬＥＷ／ＨｓｄＵｎｉｂ、ハーラン、米国、１９９６年）を使用した。ラットは深い麻酔下 (3% イソフルラン; Cristália®) で人道的に安楽死させられ、その後断頭されました。 16 ～ 20 個の胸部および腰部 DRG を収集し、ハンクス平衡塩類溶液 (HBSS、10 mM HEPES を含む) に入れました。次に、0.28 U/mL のコラゲナーゼ II 型を含む HBSS と 37 °C で 60 分間、続いて 0.25 mg/mL トリプシン中で 6 分間インキュベートすることにより細胞を解離させました。トリプシン作用を阻害するために、細胞をウシ胎児血清（FBS; 10%）、50 U/mL のペニシリン、および 50 mg/mL のストレプトマイシンを添加した DMEM で 2 回洗浄しました。機械的に解離した細胞を、ラミニンおよびポリ-D-リジンでコーティングされたカバースリップ上にプレーティングし、37 °C および 5% CO2 で維持しました。 Vitrocell Embriolife (カンピナス、SP、ブラジル) から購入した FBS を除き、すべての細胞培養用品は Sigma-Aldrich® から購入しました。

正常血糖（5.5 mMのグルコース）または高血糖（55 mMのグルコース）の細胞培地下での24時間のインキュベーションの完了後、感覚DRGニューロンを、表1に記載されているのと同じパラメータで、ただし「スワイプ動作」を介した間接的な接触でPBMTに曝露しました。ここで、レーザープローブの出力は細胞培地から1cm離れた距離に保たれました。照射直後、DRG 培養ニューロンを、10 µM の FLUO-4、AM、および 1% PowerLoad (Thermo Scientific™) を含む HBSS 中で 40 分間、37 °C、5% CO2 で光から保護してインキュベートしました。カバースリップを灌流チャンバー (Warner Instruments、ホリストン、マサチューセッツ州、米国) に挿入し、DFC360 FX カメラとライカ蛍光光源 CTR 7000 HS (480 nm 励起、527/30 nm) に接続された倒立ライカ DMi6000 B 顕微鏡上に置きました。抑制フィルター) (ライカマイクロシステムズ)。コンピューター制御のバルブシステム (Warner Instruments) をさまざまな KCl モル濃度 [5 mM (基礎)、15 mM (部分)、および 50 mM (最大)] で細胞灌流に使用し、流速を 5 mL/に設定しました。 min (2 秒ごとのチャンバー容積の完全な変化)73,108。画像は 1 画像/秒の速度で撮影され、蛍光強度 (Δ[Ca2+]i) の値は ΔF/F0 で正規化されました。ここで、ΔF は最終蛍光 (F) から基礎蛍光 (F0) を引いたものに等しいです。データは、次の 4 つの異なる状況における、50 mM KCl に応答する細胞の総数に関する 15 mM KCl 応答細胞の割合としても示されました。(i) 細胞が低グルコース中でインキュベートされた場合。 (ii) 低グルコースと PBMT。 (iii) 高グルコース、または (iv) 高グルコースと PBMT。

グループと治療時間の間の比較のために、二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定を使用しました。一元配置分散分析により 3 つ以上のグループ間で他の比較が行われ、その後ボンフェローニ事後検定が行われました。 2 つのグループのみを比較するために、対応のない Student t 検定を使用しました。 p < 0.05 (*)、p < 0.01 (**)、および p < 0.001 (***) は統計的に有意であるとみなされました。すべての統計的テストは、GraphPad Prism® ソフトウェア、バージョン 5 および 7 で実行されました。数値は、平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表されました。

この研究の結果を裏付けるデータは、責任著者 [CAP] からの要求に応じて入手可能です。

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この研究は、サンパウロ研究財団 (FAPESP) (助成金 2014/25153-7; 2015/12673-5; 2018/05108-8) および高等教育職員改善調整調整局 (CAPES) の資金提供を受けました。画像取得に関する支援をいただいた細胞生物学に応用された国立科学・フォトニクス技術研究所 (INFABiC、カンピーナス、ブラジル) に感謝いたします。また、あらゆる技術サポートをしていただいた César Eduardo Bissoto にも感謝いたします。

カンピナス大学生物学研究所構造機能生物学部 (UNICAMP)、Carl von Linnaeus n/n、Cidade Universitária Zeferino Vaz、カンピナス、SP、13083-864、ブラジル

ウィリアンズ・フェルナンド・ヴィエイラ、カウエ・フランコ・マランジェ、シルヴィアーヌ・フェルナンデス・デ・マガリャエス、ジュリア・ボルヘス・パエス・レメス、ジルソン・ゴンサルベス・ドス・サントス、カタリーヌ・マスカート・西島、アレクサンドル・レイテ・ロドリゲス・デ・オリベイラ、マリア・アリス・ダ・クルス＝ヘフリング、クラウディア・エレーラ・タンベリ、カルロス・アミルカル・パラダ

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WFV と CAP が研究を設計しました。 WFV、KFM、SFM、JBPL、GGS、および CMN が実験を実施しました。 WFV、ALRO、MACH、CHT、CAP が原稿を作成しました。著者全員が原稿を批判的にレビューし、投稿を承認しました。

カルロス・アミルカル・パラダへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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ヴィエイラ、WF、マランジェ、KF、デ・マガリャイス、SF 他ストレプトゾトシン誘発性糖尿病性神経障害に対するフォトバイオモジュレーション療法 (904 nm) の抗痛覚過敏効果は、MAPK 経路とカルシウム動態の調節を示唆しています。 Sci Rep 12、16730 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-19947-2

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受理日: 2022 年 9 月 6 日

公開日: 2022 年 10 月 6 日

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